Limpieza automatizada de muestras mediante cromatografía de flujo turbulento mediante LC-MS

Por Dan Kalu Appulage, especialista en gestión de productos

19.02.2025

La preparación de muestras es un paso fundamental en el análisis por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) para lograr precisión y exactitud cuantitativas. Inyectar muestras crudas directamente en el instrumento sin una limpieza previa para eliminar los compuestos que interfieren puede obstruir el flujo, dañar el detector y afectar negativamente los análisis a través de un “efecto matriz”.

Los métodos habituales para limpiar muestras y suprimir el efecto de la matriz incluyen desde la simple dilución y la centrifugación hasta las técnicas de extracción extensiva. El objetivo común de todos estos procedimientos es minimizar la posible contaminación de su sistema LC-MS, pero, lo que es más importante, reducir al mínimo la interferencia de componentes de la muestra no relacionados en la detección y cuantificación de los analitos de interés.

Un punto a tener en cuenta es que el método de preparación que elija a menudo depende de la complejidad de su muestra. Por ejemplo, las muestras para aplicaciones de investigación clínica o toxicología tienden a tener altos niveles de matriz interferente y requieren un enfoque de limpieza más sofisticado. Profundicemos en lo que es un efecto de matriz, los impactos en sus datos LC-MS y un método eficaz llamado cromatografía de flujo turbulento que puede utilizar para limpiar muestras complejas.

¿Qué es exactamente el efecto de matriz?

Cualquier entidad química en su muestra capaz de coeluir o interactuar con analitos de interés puede generar el efecto de matriz, lo que en última instancia afecta la integridad de sus datos.

Los compuestos de matriz que interfieren provienen de fuentes endógenas y exógenas, pero las muestras biológicas como la sangre o el suero, y los extractos de alimentos y ambientales tienen inherentemente niveles más altos de compuestos que interfieren.

Algunos ejemplos de compuestos de matriz que interfieren incluyen sales supresoras de iones, proteínas, lípidos, compuestos capaces de interacciones de apareamiento de iones y polímeros.

¿Cómo afecta el efecto de la matriz a los datos de LC-MS?

Debido a que los compuestos de la matriz interfieren en la detección y cuantificación de los analitos de destino, los efectos en última instancia conducen a una subestimación o sobreestimación en la cuantificación de los analitos.

En el caso de LC-MS, el efecto de la matriz desencadena la supresión de iones, que ocurre cuando los compuestos de la matriz de la muestra inhiben la transferencia de carga desde la fuente de iones a los analitos de destino; un excelente ejemplo es la ionización por electrospray, donde la detección depende de una transferencia de carga eficiente a los analitos.

Los analitos y los componentes de la matriz competirán naturalmente por la carga disponible de la fuente de iones de MS. Y cuando los compuestos de la matriz de la muestra están presentes en concentraciones más altas que los analitos, estas moléculas no deseadas pueden capturar más carga, dejando menos iones disponibles para la transferencia de carga a los analitos.

Por lo tanto, la supresión de la transferencia de carga a los analitos conduce a una precisión deficiente y a límites de detección y cuantificación.

Métodos de preparación de muestras para eliminar la matriz que interfiere

Si se utiliza el ejemplo de la supresión de iones, se puede ver cómo la eliminación de la competencia por la transferencia de carga entre los componentes de la matriz y los analitos mediante una limpieza adecuada de la muestra es esencial para desarrollar un método con precisión cuantitativa.

La extracción en fase sólida (SPE) y la extracción líquido-líquido (LLE) son técnicas que se utilizan para limpiar las muestras antes del análisis LC-MS. 

En la SPE, se carga una muestra líquida en una columna llena de un material adsorbente sólido. Los analitos de interés se retienen en el material adsorbente mientras que los componentes no deseados de la matriz se eliminan por lavado. A continuación, los analitos retenidos se eluyen utilizando un disolvente. Este enfoque se desarrolla normalmente en un panel específico de analitos objetivo.

La LLE se basa en la solubilidad diferencial de los analitos entre dos disolventes inmiscibles; una vez que se alcanza un equilibrio de partición, el disolvente enriquecido se separa y, normalmente, se evapora hasta secarse y se reconstituye en un disolvente compatible con LC-MS.

Independientemente del enfoque de preparación de muestras que decida utilizar, estos procedimientos manuales son imprecisos, consumen mucho tiempo y trabajo; incluso una limpieza rápida y sencilla está sujeta a errores humanos, como un pipeteo inadecuado o una mezcla de muestras.

Limpieza automatizada de muestras en línea para preparaciones de muestras eficientes

Para superar los cuellos de botella y los riesgos de los enfoques manuales, la limpieza automatizada de muestras está ganando popularidad, gracias a una intervención humana mucho menor combinada con una mejor velocidad y reproducibilidad analítica.

La SPE en línea es una mejora con respecto a las manuales, donde el proceso de extracción se integra directamente con su sistema LC. La muestra se inyecta automáticamente en un cartucho de extracción, se realiza la limpieza y la muestra extraída se transfiere directamente al instrumento MS (análisis de inyección de flujo) o a una columna analítica para una mayor separación y detección.

La cromatografía de flujo turbulento (TurboFlow) es un enfoque de limpieza de muestras en línea más avanzado que combina los aspectos de la afinidad química de la SPE con la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

¿Cómo funciona la cromatografía de flujo turbulento?

TurboFlow separa las moléculas de bajo peso molecular de los componentes de la matriz de alto peso molecular mediante una columna de extracción de muestras especializada en sistemas LC (Figura 2).

A continuación, se muestra una descripción detallada de cómo funciona TurboFlow:

La muestra se inyecta directamente en una columna TurboFlow (normalmente, partículas de tamaño > 50 µm con macroporos).

La ​​muestra fluye a través de la columna a altas velocidades lineales, lo que crea turbulencia para mejorar la interacción entre los componentes de la muestra y la fase estacionaria.

Las moléculas de bajo peso molecular se difunden en los poros más rápido que los componentes de alto peso molecular y se eliminan rápidamente. Solo las moléculas pequeñas con afinidad por la química de las partículas se unen a las superficies internas de los poros.

Un cambio en la composición de la fase móvil eluye las moléculas pequeñas unidas por la columna TurboFlow para una mayor separación y detección.

1- TurboFlow proporciona una muestra más limpia en comparación con SPE

• El modo de acción dual más eficiente (afinidad química más SEC)
• La elución realizada por un tapón de solvente fuerte reduce potencialmente la transferencia de componentes de matriz residuales a su MS

2- Una muestra más limpia significa

• Supresión iónica reducida, lo que lleva a una mayor sensibilidad
• Menos contaminación del espectrómetro de masas
• Vida útil prolongada de la columna analítica
• Gradientes analíticos más rápidos

Además, la oportunidad de modular la fuerza de la fase móvil que llega a la columna analítica permite una mejor concentración del analito en la cabeza de la columna, lo que mejora significativamente su cromatografía.